Метод Кьельдаля, определение азота и белка
Разбираем сущность метода Кьельдаля. Как проводить разложение, дистилляцию и титрование. Определение содержания азота и белка.
Метод Кьельдаля, определение азота и белка
Разбираем сущность метода Кьельдаля. Как проводить разложение, дистилляцию и титрование. Определение содержания азота и белка.
Метод определения азота по Кьельдалю был разработан в 1883 году в химической лаборатории датской пивоваренной компании Карлсберг, где Йохан Кьельдаль занимался исследованием процессов брожения. Он выявил зависимость готовности пива от содержания белка в сусле и охарактеризовал её так: "Less protein meant more beer" Меньше белка – больше пива.
Азот являются строительным материалом для любых клеток, и он также важен для роста и размножения клеток дрожжей.
Азот являются строительным материалом для любых клеток, и он также важен для роста и размножения клеток дрожжей.
В исследовании Кьельдаля, источником азота для дрожжей служили белки пивного солода (злаков). Для определения содержания азота, Кьельдаль создал установку разложения органических продуктов и сформулировал метод количественного определения азота. Спустя несколько лет, методика определения азота по Кьельдалю была опубликована в научных журналах Германии и Франции, и получила широкое распространение. В наши дни метод определения азота по Кьельдалю является референтным методом и используется для проверки правильности определения азота другими методами.
Сущность метода Кьельдаля заключается в переводе органического азота в аммонийную форму, в процессе термического разложения образца с кислотой, дальнейшая дистилляция полученной смеси со щелочью для перевода аммонийного азота в аммиак, поглощение аммиака водным раствором и титрование полученного раствора. Метод Кьельдаля является универсальным и используется для определения содержания азота в пищевых и фармацевтических продуктах, текстиле, полимерах, объектах окружающей среды и т.д.
Следует различать понятия общий азот по Кьельдалю и общий азот. Общий азот по Кьельдалю обозначается TKN (Total Kjeldahl Nitrogen) и представляет собой сумму органических форм азота и аммонийного азота. При анализе почв и сточных вод помимо органического и аммонийного азота также будет учитываться аммиачный азот.
Азот содержащейся в виде нитратов и нитритов при анализе по методу Кьельдаля не учитывается. Общее содержание азота во всех органических и неорганических формах обозначается TN (Total Nitrogen) и определяется как сумма азота по Кьельдалю и азота в форме нитратов и нитритов.
Органический азот гетероциклических соединений при разложении по Кьельдалю не переходит в аммонийную форму, поэтому образцы с гетероциклами азота не исследуют методом Кьельдаля.
Азот содержащейся в виде нитратов и нитритов при анализе по методу Кьельдаля не учитывается. Общее содержание азота во всех органических и неорганических формах обозначается TN (Total Nitrogen) и определяется как сумма азота по Кьельдалю и азота в форме нитратов и нитритов.
Органический азот гетероциклических соединений при разложении по Кьельдалю не переходит в аммонийную форму, поэтому образцы с гетероциклами азота не исследуют методом Кьельдаля.
Общий азот по Кьельдалю
Разложение по Кьельдалю
Процедура разложения пробы по методу Кьельдаля является самой продолжительной и трудоемкой стадией анализа. На этой стадии происходит перевод органических форм азота в аммонийный азот, процесс протекает при нагревании под действием серной кислоты в присутствии катализаторов (сульфата меди, сульфата ртути). В классическом методе разложение проводят в круглодонных колбах помещенных в песчаную баню или колбонагреватель. Кьельдаль использовал для разложения круглодонные колбы с длинным горлом, позже их стали именовать колбами Кьельдаля.
Скорость и полнота разложения пробы зависят от температуры, чем выше температура, тем эффективнее протекает разрушение матрицы и образование сульфата аммония. При этом чрезмерный нагрев образца может привести к потере азота, а занижение температуры к неполному извлечению азота из матрицы. Ошибки при выполнении разложения по Кьельдалю могут быть критичны для достоверности и повторяемости результата анализа. Именно в проведении стадии разложения содержаться основные отличия анализа по Кьельдалю различных образцов.
Контроль процесса разложения по Кьельдалю
В ходе разложения органических образцов происходит вспенивание и обугливание органической матрицы, смесь в сосуде приобретает черный цвет. Об окончании процесса разложения свидетельствует образование в реакционной колбе прозрачного раствора.
Полноту извлечения и отсутствие потерь в процессе разложения по Кьельдалю контролируют с помощью стандартных веществ с известным содержанием азота, которые вносят в одну из реакционных колб. Для легкоразлагаемых проб используют N-фенилацетамид C8H9ON, содержащий 10,36 % азота. Для трудно минерализуемых проб используют триптофан C11H12N2O2 , содержащий 13,72% азота. Извлечение азота для N-фенилацетамид должно быть не менее 99,5%, для триптофана не менее 99%.
CHNO + H2SO4→ H2O + CO2 + SO2 + (NH4)2SO4
Для упрощения этого трудоемкого процесса, минимизации потерь и получения достоверных результатов многие производители лабораторного оборудования разрабатывают системы разложения (дегисторы). Дегистор создает повторяемые условия разложения нескольких образцов и утилизирует едкие пары кислот.
На российском рынке представлены дегисторы для разложения по Кьельдалю на 4, 6, 8, 12 и 20 образцов отечественных (ЛОиП, Вилитек) и импортных производителей (Velp, Gerhardt, Buchi).
На российском рынке представлены дегисторы для разложения по Кьельдалю на 4, 6, 8, 12 и 20 образцов отечественных (ЛОиП, Вилитек) и импортных производителей (Velp, Gerhardt, Buchi).
Дистилляция (перегонка с паром)
На этой стадии переводят аммонийный азот в аммиак и отгоняют полученный аммиак с водяным паром. Аммиак выделяется в ходе реакции смеси полученной на стадии разложения с концентрированной щелочью. Раствор после стадии разложения содержит избыток серной кислоты, поэтому щелочь берут в избытке, для нейтрализации серной кислоты и реакции сульфатом аммония.
В классическом варианте содержимое колбы Кьельдаля количественно переносят в перегонную колбу, добавляют дистиллированную воду и избыток концентрированного раствора гидроксида натрия. Перегонную колбу нагревают и перегоняют аммиак в приемную колбу. Скорость перегонки зависит от температуры, однако, даже при слабом нагреве весь аммиак отгоняется в течение 10 минут. Для поглощения паров аммиака в приемную колбу добавляют 3-4 % борную кислоту, либо стандартизованный раствор соляной кислоты.
Чтобы сократить ручные операции и уменьшить потерю аммиака производители лабораторного оборудования предлагают дистилляторы для автоматизации этой стадии. В дегисторах и дистилляторах Кьельдаля одного производителя сосуды для разложения пробы совместимы с установками для дистилляции, это позволяет избежать количественного переноса вещества из одного сосуда в другой. Дозирование раствора щелочи, разбавление образца и подача пара со встроенного парогенератора в таких приборах автоматизированы и внесены во встроенные программы.
Качество процесса перегонки с паром можно проконтролировать добавлением известного количества сульфата аммония или хлорида аммония в сосуд перед началом процесса отгонки. Степень отгонки аммиака в приемный сосуд должна быть не менее 99,5%. В противном случае необходимо выбрать другую программу перегонки.
(NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O
Поглощение аммиака раствором борной кислоты
2NH3 + 4H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 5H2O
Поглощение аммиака раствором соляной кислоты
NH3 + HCl → NH4Cl
Титрование по Кьельдалю
Количество аммиака в приемной колбе определяют титрованием.
Если в качестве поглотителя в приемной колбе использовалась сильная кислота (HCl, H 2SO4), то титрование проводят раствором щелочи. Это будет обратное титрование, в ходе него титруют избыток сильной кислоты, оставшейся после реакции с аммиаком. Точку эквивалентности определяют потенциометрически или при помощи индикатора метиловый красный.
Если в качестве поглотителя в приемной колбе использовалась сильная кислота (HCl, H 2SO4), то титрование проводят раствором щелочи. Это будет обратное титрование, в ходе него титруют избыток сильной кислоты, оставшейся после реакции с аммиаком. Точку эквивалентности определяют потенциометрически или при помощи индикатора метиловый красный.
Если поглотителем в приемной колбе был раствор борной кислоты, то в качестве титранта используют соляную кислоту. Титрование проводят вручную или с использованием титратора, определяя точку эквивалентности потенциометрически или с использованием смешенного индикатора метиловый красный + метиленовый голубой. Поглотительный раствор с борной кислотой необходимо титровать сразу после окончания процесса дистилляции, чтобы избежать потери аммиака.
Изначально Кьельдаль использовал в качестве поглотителя аммиака раствор соляной кислоты, и содержание аммиака определял йодометрическим титрованием. В наше время большее распространение получило использование в качестве поглотителя 4% борной кислоты и титрование раствором щелочи.
На сегодняшний день автоматизирована и стадия титрования. Современные производители анализаторов Кьельдаля совмещают титраторы с дистилляторами. Датчики титратора располагаются в приемном сосуде дистиллятора, и титрование проводится автоматически по завершению процесса отгонки с паром.
После завершения титрования рассчитывают массу азота в анализируемом образце.
Обратное титрование
mN = ((Vхол – Vобр) * СNaOH * TITER * 14) / 1000
Прямое титрование
mN = ((Vобр – Vхол) * СHCl * TITER * 14) / 1000
Расчет белка по методу Кьельдаля
Органически связанный азот содержится в белках, аминокислотах, нуклеиновых кислотах и играет важную роль в метаболизме живых организмов. Содержание азота в различных индивидуальных молекулах белка колеблется в диапазоне от 14 до 19%. Обычно при пересчете содержания азота в содержание белка используется усредненное содержание азота в белке – 16 %. Таким образом, коэффициент пересчета на белок равен 100/16=6,25.
В некоторых продуктах питания преобладают белки определенного типа, для них определены другие коэффициенты пересчета.
Методики определения азота по Кьельдалю
ГОСТ 23327-98, Молоко и молочные продукты. Метод измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определение массовой доли белка
ГОСТ 26889-86, Продукты пищевые и вкусовые. Общие указания по определению содержания азота методом Кьельдаля
ГОСТ 28743-93 (ИСО 333-96), Топливо твердое минеральное. Методы определения азота
ГОСТ 34111-2017, Продукция соковая. Определение содержания азота методом Кьельдаля
ГОСТ 34454-2018, Продукция молочная. Определение массовой доли белка методом Кьельдаля
ГОСТ 34536-2019, Молоко и молочная продукция. Определение массовой доли сывороточных белков методом Кьельдаля
ГОСТ 34789-2021, Продукция пивоваренная. Идентификация. Определение массовой концентрации общего азота методом Кьельдаля
ГОСТ 17837-2013, Продукты сырные плавленые. Определение содержания азота и расчет содержания общего белка. Метод Кьельдаля
ГОСТ Р 54662-2011, Сыры и сыры плавленые. Определение массовой доли белка методом Кьельдаля
ГОСТ Р 55246-2012, Молоко и молочные продукты. Определение содержания небелкового азота с применением метода Кьельдаля
ОФС.1.2.3.0011.15, Определение азота в органических соединениях методом Кьельдаля
ПНД Ф 14.1:2:4.277-2013 Количественный химический анализ вод. Методика измерений массовых концентраций азота органического методом Кьельдаля в питьевых, природных и сточных водах
ПНД Ф 16.1:2:2.3.82-2013 Количественный химический анализ почв и отходов. Методика определения азота общего методом Кьельдаля в осадках сточных вод, органических удобрений, грунтах тепличных и почвах
ASTM D3228-22, Standard Test Method for Total Nitrogen in Lubricating Oils and Fuel Oils by Modified Kjeldahl Method
ASTM D3590-17, Standard Test Methods for Total Kjeldahl Nitrogen in Water
ГОСТ 26889-86, Продукты пищевые и вкусовые. Общие указания по определению содержания азота методом Кьельдаля
ГОСТ 28743-93 (ИСО 333-96), Топливо твердое минеральное. Методы определения азота
ГОСТ 34111-2017, Продукция соковая. Определение содержания азота методом Кьельдаля
ГОСТ 34454-2018, Продукция молочная. Определение массовой доли белка методом Кьельдаля
ГОСТ 34536-2019, Молоко и молочная продукция. Определение массовой доли сывороточных белков методом Кьельдаля
ГОСТ 34789-2021, Продукция пивоваренная. Идентификация. Определение массовой концентрации общего азота методом Кьельдаля
ГОСТ 17837-2013, Продукты сырные плавленые. Определение содержания азота и расчет содержания общего белка. Метод Кьельдаля
ГОСТ Р 54662-2011, Сыры и сыры плавленые. Определение массовой доли белка методом Кьельдаля
ГОСТ Р 55246-2012, Молоко и молочные продукты. Определение содержания небелкового азота с применением метода Кьельдаля
ОФС.1.2.3.0011.15, Определение азота в органических соединениях методом Кьельдаля
ПНД Ф 14.1:2:4.277-2013 Количественный химический анализ вод. Методика измерений массовых концентраций азота органического методом Кьельдаля в питьевых, природных и сточных водах
ПНД Ф 16.1:2:2.3.82-2013 Количественный химический анализ почв и отходов. Методика определения азота общего методом Кьельдаля в осадках сточных вод, органических удобрений, грунтах тепличных и почвах
ASTM D3228-22, Standard Test Method for Total Nitrogen in Lubricating Oils and Fuel Oils by Modified Kjeldahl Method
ASTM D3590-17, Standard Test Methods for Total Kjeldahl Nitrogen in Water