Метод Кьельдаля, определение азота и белка

Процедура разложения пробы по методу Кьельдаля является самой продолжительной и трудоемкой стадией анализа. На этой стадии происходит перевод органических форм азота в аммонийный азот, процесс протекает при нагревании под действием серной кислоты в присутствии катализаторов (сульфата меди, сульфата ртути). В классическом методе разложение проводят в круглодонных колбах помещенных в песчаную баню или колбонагреватель. Кьельдаль использовал для разложения круглодонные колбы с длинным горлом, позже их стали именовать колбами Кьельдаля.

Скорость и полнота разложения пробы зависят от температуры, чем выше температура, тем эффективнее протекает разрушение матрицы и образование сульфата аммония. При этом чрезмерный нагрев образца может привести к потере азота, а занижение температуры к неполному извлечению азота из матрицы. Ошибки при выполнении разложения по Кьельдалю могут быть критичны для достоверности и повторяемости результата анализа. Именно в проведении стадии разложения содержаться основные отличия анализа по Кьельдалю различных образцов.

В ходе разложения органических образцов происходит вспенивание и обугливание органической матрицы, смесь в сосуде приобретает черный цвет. Об окончании процесса разложения свидетельствует образование в реакционной колбе прозрачного раствора.

Полноту извлечения и отсутствие потерь в процессе разложения по Кьельдалю контролируют с помощью стандартных веществ с известным содержанием азота, которые вносят в одну из реакционных колб. Для легкоразлагаемых проб используют N-фенилацетамид C₈H₉ON, содержащий 10,36 % азота. Для трудно минерализуемых проб используют триптофан C₁₁H₁₂N₂O₂ , содержащий 13,72% азота. Извлечение азота для N-фенилацетамид должно быть не менее 99,5%, для триптофана не менее 99%.

CHNO + H₂SO₄→ H₂O + CO₂ + SO₂ + (NH₄)₂SO₄

Для упрощения этого трудоемкого процесса, минимизации потерь и получения достоверных результатов многие производители лабораторного оборудования разрабатывают системы разложения (дегисторы). Дегистор создает повторяемые условия разложения нескольких образцов и утилизирует едкие пары кислот.
На российском рынке представлены дегисторы для разложения по Кьельдалю на 4, 6, 8, 12 и 20 образцов отечественных (ЛОиП, Вилитек) и импортных производителей (Velp, Gerhardt, Buchi).

На этой стадии переводят аммонийный азот в аммиак и отгоняют полученный аммиак с водяным паром. Аммиак выделяется в ходе реакции смеси полученной на стадии разложения с концентрированной щелочью. Раствор после стадии разложения содержит избыток серной кислоты, поэтому щелочь берут в избытке, для нейтрализации серной кислоты и реакции сульфатом аммония.

В классическом варианте содержимое колбы Кьельдаля количественно переносят в перегонную колбу, добавляют дистиллированную воду и избыток концентрированного раствора гидроксида натрия. Перегонную колбу нагревают и перегоняют аммиак в приемную колбу. Скорость перегонки зависит от температуры, однако, даже при слабом нагреве весь аммиак отгоняется в течение 10 минут. Для поглощения паров аммиака в приемную колбу добавляют 3-4 % борную кислоту, либо стандартизованный раствор соляной кислоты.

Чтобы сократить ручные операции и уменьшить потерю аммиака производители лабораторного оборудования предлагают дистилляторы для автоматизации этой стадии. В дегисторах и дистилляторах Кьельдаля одного производителя сосуды для разложения пробы совместимы с установками для дистилляции, это позволяет избежать количественного переноса вещества из одного сосуда в другой. Дозирование раствора щелочи, разбавление образца и подача пара со встроенного парогенератора в таких приборах автоматизированы и внесены во встроенные программы.

Качество процесса перегонки с паром можно проконтролировать добавлением известного количества сульфата аммония или хлорида аммония в сосуд перед началом процесса отгонки. Степень отгонки аммиака в приемный сосуд должна быть не менее 99,5%. В противном случае необходимо выбрать другую программу перегонки.

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH → 2NH₃ + Na₂SO₄ + 2H₂O

Поглощение аммиака раствором борной кислоты

2NH₃ + 4H₃BO₃ → (NH₄)₂B₄O₇ + 5H₂O

Поглощение аммиака раствором соляной кислоты

NH₃ + HCl → NH₄Cl

Количество аммиака в приемной колбе определяют титрованием.

Если в качестве поглотителя в приемной колбе использовалась сильная кислота (HCl, H ₂SO₄), то титрование проводят раствором щелочи. Это будет обратное титрование, в ходе него титруют избыток сильной кислоты, оставшейся после реакции с аммиаком. Точку эквивалентности определяют потенциометрически или при помощи индикатора метиловый красный.

Если поглотителем в приемной колбе был раствор борной кислоты, то в качестве титранта используют соляную кислоту. Титрование проводят вручную или с использованием титратора, определяя точку эквивалентности потенциометрически или с использованием смешенного индикатора метиловый красный + метиленовый голубой. Поглотительный раствор с борной кислотой необходимо титровать сразу после окончания процесса дистилляции, чтобы избежать потери аммиака.

Изначально Кьельдаль использовал в качестве поглотителя аммиака раствор соляной кислоты, и содержание аммиака определял йодометрическим титрованием. В наше время большее распространение получило использование в качестве поглотителя 4% борной кислоты и титрование раствором щелочи.

На сегодняшний день автоматизирована и стадия титрования. Современные производители анализаторов Кьельдаля совмещают титраторы с дистилляторами. Датчики титратора располагаются в приемном сосуде дистиллятора, и титрование проводится автоматически по завершению процесса отгонки с паром.

После завершения титрования рассчитывают массу азота в анализируемом образце.

Обратное титрование

m_N = ((V_хол – V_обр) * С_NaOH * TITER * 14) / 1000

Прямое титрование

m_N = ((V_обр – V_хол) * С_HCl * TITER * 14) / 1000

Органически связанный азот содержится в белках, аминокислотах, нуклеиновых кислотах и играет важную роль в метаболизме живых организмов. Содержание азота в различных индивидуальных молекулах белка колеблется в диапазоне от 14 до 19%. Обычно при пересчете содержания азота в содержание белка используется усредненное содержание азота в белке – 16 %. Таким образом, коэффициент пересчета на белок равен 100/16=6,25.

В некоторых продуктах питания преобладают белки определенного типа, для них определены другие коэффициенты пересчета.

ГОСТ 23327-98, Молоко и молочные продукты. Метод измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определение массовой доли белка
ГОСТ 26889-86, Продукты пищевые и вкусовые. Общие указания по определению содержания азота методом Кьельдаля
ГОСТ 28743-93 (ИСО 333-96), Топливо твердое минеральное. Методы определения азота
ГОСТ 34111-2017, Продукция соковая. Определение содержания азота методом Кьельдаля
ГОСТ 34454-2018, Продукция молочная. Определение массовой доли белка методом Кьельдаля
ГОСТ 34536-2019, Молоко и молочная продукция. Определение массовой доли сывороточных белков методом Кьельдаля
ГОСТ 34789-2021, Продукция пивоваренная. Идентификация. Определение массовой концентрации общего азота методом Кьельдаля
ГОСТ 17837-2013, Продукты сырные плавленые. Определение содержания азота и расчет содержания общего белка. Метод Кьельдаля
ГОСТ Р 54662-2011, Сыры и сыры плавленые. Определение массовой доли белка методом Кьельдаля
ГОСТ Р 55246-2012, Молоко и молочные продукты. Определение содержания небелкового азота с применением метода Кьельдаля
ОФС.1.2.3.0011.15, Определение азота в органических соединениях методом Кьельдаля
ПНД Ф 14.1:2:4.277-2013 Количественный химический анализ вод. Методика измерений массовых концентраций азота органического методом Кьельдаля в питьевых, природных и сточных водах
ПНД Ф 16.1:2:2.3.82-2013 Количественный химический анализ почв и отходов. Методика определения азота общего методом Кьельдаля в осадках сточных вод, органических удобрений, грунтах тепличных и почвах
ASTM D3228-22, Standard Test Method for Total Nitrogen in Lubricating Oils and Fuel Oils by Modified Kjeldahl Method
ASTM D3590-17, Standard Test Methods for Total Kjeldahl Nitrogen in Water